Wir testen für Sie Zellkulturen oder andere biologischen Materialien
 Nachweis von SMRV in Zelllinien
Testspezifikationen
Testverfahren
Ergebnisreport/Vertraulichkeit
Probenmaterial
Probenvorbereitung und Versand
Was
zu beachten ist
Nachweis von SMRV in Zelllinien
Das SMRV (Squirrel Monkey Retrovirus) ist ein 1977 aus dem Lungengewebe
eines Totenkopfäffchens (Saimiri sciureus) isoliertes endogenes Typ
D Retrovirus, das der Gattung Betaretrovirus zugeordnet wird. Natürliche
Infektionen anderer Wirte sind nicht beschrieben. Aufgrund der Kontamination
zahlreicher Vertebraten-Zelllinien (von Mensch, Hund, Nerz, Alt- und Neuweltaffe)
verfügt es in vitro über einen breiten Wirtstropismus.
Aus Überwachung gentechnischer Arbeiten wurden umfangreiche Kontaminationen
von Vertebraten-Zelllinien mit dem SMRV berichtet. Die Prüfung des
Sachverhalts durch die Zentrale Kommission für Biologische Sicherheit
(ZKBS) hat Anlass zur Befürchtung gegeben, dass der Austausch von
Zellkulturen und Proben zwischen Laboren zu einer weiteren Verbreitung
der SMRV-Kontaminationen geführt haben kann.
Die Zentrale Kommission für die
Biologische Sicherheit (ZKBS) empfiehlt daher den PCR-basierten Nachweis
von SMRV für alle verwendeten Zelllinien. Die Befunde sind der Behörde
zu melden und werden bei Kontrollen abgefragt.
>>> Stellungnahme
der ZKBS zur Kontamination von Zelllinien
mit dem Squirrel Monkey Retrovirus
>>> Bericht
der Geschäftstelle der ZKBS zu SMRV
Testspezifikation
Nachweis des SMRV nach DNA Extraktion und ggf. RT-PCR nach RNA Extraktion
mit den SMRV-spezifischen Sequenzen (gag und env). In
jeder PCR wir ein SMRV-Kontrollplasmid als Positivkontrolle mitgeführt.
Als Prozeßkontrolle wird die Expression von ß-Aktin als Referenz
getestet.
Testverfahren
(A) PCR-basierter Nachweis von SMRV in Zelllinien und Kulturüberständen
(SMRV Screen, Art.-Nr. 41-1005).
(B) Wenn (A) positiv erfolgt eine cDNA Synthese aus zuvor isolierter RNA
mit anschließendem PCR Direktnachweis (Art.-Nr. 41-4005)
Zu A) Nachweis des Provirus
Um zu prüfen, ob die Zelllinie mit dem SMRV infiziert ist, wird die
zuvor mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit (z.B. QIAamp)
isolierte genomische DNA mit dem PCR-Nachweis auf die SMRV-spezifischen
Genabschnitte gag und env analysiert. Hiermit wird die
provirale DNA des Virus nachgewiesen. Die untersuchte Zelllinie kann als
SMRV-frei betrachtet werden, wenn die Sequenz-Nachweise gag und
env in genomischer DNA negativ waren und ein positives Ergebnis
mit dem SMRV-Kontroll-Plasmid erhalten wurde. Ein positives Untersuchungsergebnis
für die viralen Genabschnitte gag und env ist als
Nachweis einer Infektion der Zelllinie mit SMRV zu werten.
Zu B) Nachweis replikativer Viren
Bei einem SMRV-gag und SMRV-env positiven Ergebnis wird
geprüft, ob die Virusgene transkribiert werden und ob Viren von der
Zelllinie freigesetzt werden. Nachgewiesen wird nur die virale RNA. Zur
Isolierung des RNA–Genoms aus dem Zellkulturüberstand wird
ein handelsüblicher Kit verwendet (z.B. QIAamp Viral RNA Mini Kit).
Aus der hergestellten RNA wird cDNA synthetisiert, mit dieser dann der
PCR Nachweis der SMRV-spezifischen Sequenzen erfolgt.
Zur Überprüfung aller Verfahrensschritte (Nukleinsäureisolierung
und PCR-Nachweis) wird der Nachweis eines konstitutiv exprimierten Refernzgens
(ß-Aktin) durchgeführt.
Ergebnisreport/Vertraulichkeit
- das Testergebnis wird mittels Fax oder E-mail auf Wunsch vorab mitgeteilt
- im Nachgang wird ein Bericht mit einem Ausdruck des Gelbildes übermittelt
- alle Kundeninformationen werden strikt vertraulich behandelt
- Vertraulichkeitserklärungen und Abgrenzungsverträge verfügbar
- externe Kontrollaudits möglich
- die Ergebnisse werden in unserem Archiv für fünf Jahre und
die Proben bis zur fachgerechten Entsorgung mindestens 6 Monate gelagert
Probenmaterial
- Zelllinie inklusiv Zellkulturüberstand zur DNA Extraktion und
ggf. RNA Extraktion.
Probenvorbereitung und Versand
Für den Nachweis von SMRV in Zelllinien senden Sie uns bitte 400
µl Probe in einem sterilen, dicht schließenden Gefäß
(z.B. 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß). Bei Suspensionszellen
bitte 1,5 ml bei 500 x g für 5 min abzentrifugieren und das Pellet
in 400 µl Zellkulturmedium aufnehmen, adhärente Zellen zuvor
von der Zellkulturschale abschaben und anschließend in 400 µl
Zellkulturmedium aufnehmen. Die Zellkulturen sollten bei fast vollständiger
Konfluenz (95-100%) getestet werden. Erhitzen Sie die Probe mindestens
für 10 min bei 95°C und versehen Sie das Probenröhrchen
mit einer dauerhaften und lesbaren Beschriftung.
Bitte schicken Sie das Probenmaterial, über Nacht bei Raumtemperatur
und bruchsicher verpackt (z.B. gepolsterete Postversandtasche) zusammen
mit dem unterschriebenen Begleitformular
Diagnostikservice an uns.
Für eine zweite Untersuchung, nach einem zuvor positiven SMRV-Sequenznachweis
von gag und env, senden Sie uns bitte zur Isolierung
der RNA mit anschließender sequenzspezifischer PCR eine weitere
Probe dieser Zelllinie. Aufgrund des sehr sensiblen Extraktionsverfahren,
sollten diese Proben nicht hitzeinaktiviert werden. Bitte versehen Sie
die Probenröhrchen mit einer dauerhaften Beschriftung, verpacken
Sie diese bruchsicher und versenden Sie alles mit Kühlakkus per Express-Service.
Da es sich um infektiöses Material handelt, verschicken Sie die Proben
bitte unter Berücksichtigung der DIN 58956-10 und legen der Sendung
das unterschriebene Begleitformular
Diagnostikservice bei.
Bitte beachten Sie
Minerva Biolabs akzeptiert kein Probenmaterial der Biologischen Risikogruppen 3 und 4. Der angebotene Diagnostikservice ist weder für die klinische Diagnostik noch für Anwendungen am Menschen, sondern ausschließlich für die Qualitätssicherung und Forschungszwecke geeignet.
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