DNA Polymerasen  

Können andere DNA Polymerasen als die speziellen Minerva Biolabs' Polymerasen eingesetzt werden?

Eine anbieterspezifische Liste der DNA Polymerasen, die in unserem Labor gute Ergebnisse geliefert haben, finden Sie unter "empfohlene Taqs" unter den Downloads.

Puffer  

Kann ein anderer Reaktionspuffer verwendet werden?

Es ist durchaus möglich den Venor^® oder Onar^®PCR 10x Reaktionspuffer gegen einen spezifischen Puffer, der mit Ihrer DNA Polymerase geliefert wird, einzutauschen. Bitte beachten Sie in diesem Fall, dass die Magnesium-Konzentration des Puffers auf 3.0 mM im Falle von Venor^®GeM und 4.0 mM im Falle von Onar^®Lp eingestellt wird.

Primer/Nukleotid Mix  

Kann der Primer/Nukleotid Mix ausgetauscht werden?

Der Primer/Nukleotid Mix ist gewissermaßen das Herz unserer Detektions-Systeme. Eine Modifikation an dieser Stelle würde das gesamte System verändern. Zudem ist e ine selbstgemachte Lösung zeitintensiv und oft nicht ausbalanciert.

Interne und positive Kontroll-DNA  

Die interne Kontroll-DNA ist ein kloniertes DNA Fragment, das die System-spezifischen Primer Sequenzen enthält.

Die positive Kontroll-DNA enthält PCR Amplikon DNA. Die Amplikon DNA wird in lyophilisierter Form angeboten. Die Rehydrierung der Amplikon DNA ist weder reproduzierbar noch quantitativ. Aus diesen Gründen ist es nicht möglich eine exakte Anzahl der Genom-Kopien nach der Rehydrierung anzugeben. Die positive Kontrolle kann daher nicht für eine Quantifizierung verwendet werden. Für Quantifizierungen bieten wir entsprechende Quantifizierungsstandards (genomische DNA in Wasser gelöst; Cat.-No. 52-0XXX) an.

Thermocycler

Welche Thermocycler wurden für die Entwicklung der "Real-Time" Kits verwendet?  

Die QP Detection-Kits wurden auf dem Roche LightCycler^® entwickelt.

Die DI Detection-Kits wurden auf dem Cepheid SmartCycler^® entwickelt.

Welche Geräte sind kompatibel?  

Welche Geräte sind speziell mit den 'DI' Detektionskits kompatibel?  

Smartcycler^®; ABI Prism^® 7000; Mx3000pT, Mx4000^® & ähnliche Geräte

Welche Geräte sind speziell mit den 'QP' Detektionskits kompatibel?  

LightCycler^®; OpticonT; ABI Prism^® 7000, 7300, 7500, 7700, 7900; Rotor-Gene & ähnliche Geräte.

Welche spezifischen Modifikationen bezüglich der chemischen Komposition liegen vor?  

Die chemischen Modifikationen beziehen sich ausschliesslich auf die Primer-Nukleotide.

Was sind Scorpions?  

Scorpions werden in der "real-time" Amplikon-spezifischen Detektion von PCR Produkten verwendet. Es handelt sich bei ihnen um fluorogene PCR Primer. Zwei verschiedene Formate sind denkbar, die schleifenförmige (bzw. "stem-looped") Variante oder das "Duplex"-Format. In beiden Fällen verläuft der Hybridisierungs-Mechanismus intramolekular.

Warum verwenden wir Scorpions-Primer für die quantitativen Diagnostik Assays?  

Markierte fluorogene Sonden sind nahezu ideal für den Gebrauch in diagnostischen Assays. Wir verwenden zwei Scorpions-Varianten, daher kommen auch zwei unterschiedliche PCR Detektions-Systeme zur Anwendung, das DI- und QP-Detektions Kit. Auf diese Weise decken wir nahezu alle gängigen Thermocycler ab und jeder Kunde findet das für ihn geeignete Detektions-System, speziell für sein "real-time" PCR Projekt.

Wie sind Scorpions aufgebaut und wie funktioniert die Scorpions-Technologie?  

Scorpions enthalten einen Amplifikationsprimer, der durch ein Zwischenstück, welches einen "Amplifikations-Stopper" enthält, mit einer "Target"-spezifischen Probe verknüpft ist. Die Sequenzen, die die Sonden-Sequenz flankieren sind komplementär zueinander und können daher eine Haarnadel-Struktur bilden. Auf diese Weise wird das Fluorophor mit dem Löschmolekül in räumliche Nähe gebracht. Während der Amplifikation wird die Zielsequenz von dem Primeranteil der Scorpions her verlängert. Während der Denaturierung, öffnet sich die Haarnadelstruktur. Im Verlauf der Reaktion bindet die "Target"-spezifische Probe beim Abkühlen an die amplifizierte komplementäre Target-Sequenz, so dass sich die Haarnadel-Struktur nicht erneut ausbilden kann. Fluorophor und "Quencher" (Fluoreszenz-Löscher) sind nun getrennt und Fluoreszenzlicht wird bei entsprechender Anregung detektiert. Der Amplifikations-Stopper verhindert ein "Durchlesen" während der Amplifikation, welches zwangsläufig zur Öffnung der Haarnadel-Struktur führen würde und somit zu einer Fluoreszenz-Detektion in Abwesenheit einer Zielsequenz. Da Scorpions im Produkt integriert sind, besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Anzahl generierter Zielmoleküle und der Fluoreszenz-Menge.