A) Konventionelle ("End-Point") PCR  

Beschreibung

Konventionelle PCR Methoden beziehen sich auf die Gesamtmenge an Produkt, die am Ende der Reaktion gebildet wurde und nicht auf die jeweilige Menge, die sich auf einzelne Zyklen der PCR bezieht. Unsere qualitativen Tests detektieren, ob eine Kontamination (z.B. Mykoplasmen) vorhanden ist oder nicht.

Warum ist kein Genprodukt sichtbar?

Nicht jede PCR ist erfolgreich. Ursache kann die schlechte Qualität der DNA sein, inhibierende Faktoren, die die PCR-Reaktion störend beeinflussen, Primer, die nicht passen oder die Menge an Template-DNA.

Warum hat das Gen-Produkt nicht die richtige Größe?

Es ist möglich, dass z. B. eine Bande von 300 Basenpaaren entsteht, obwohl das erwartete Genprodukt 600 Basenpaare lang ist. In diesem Fall bindet ein Primer wahrscheinlich an einer Stelle des Gens, das näher an dem zweiten Primer lokalisiert ist. Es ist auch denkbar, dass z.B. beide Primer an verschiedenen Stellen, oder sogar an einem völlig anderen Gen binden.

Warum hat das Gen-Produkt nicht die richtige Größe?

Es ist möglich, dass die Primer an den gewünschten Genabschnitten binden, sie aber auch mit weiteren Abschnitten der DNA hybridisieren können. In diesem Fall kann man verschiedene Banden in einer Bahn des Gels beobachten.

Ein Grund dafür könnte eine zu niedrige "Annealing"-Temperatur sein. Eine Erhöhung der "Annealing"-Temperatur erhöht die Spezifität der Amplifikation.

Eine weitere Ursache könnte kontaminierende Fremd-DNA in der Probe darstellen.

Welches sind die anwendungstechnischen Grenzen der End-Punkt PCR?

1. Relativ zeitintensiv im Vergleich zur real-time PCR.
2. Ergebnisse basieren auf Größen-Unterscheidung, die nicht sehr genau ist.
3. Die Reproduzierbarkeit der Amplifikation ist relativ gering.
4. Der End-Punkt variiert von Probe zu Probe.
5. Die Agarosegel-Auflösung ist relativ gering.
6. Kleiner dynamischer Bereich (kleiner als 2 logs).
7. Nicht-automatisiert.
8. Ergebnisse durch Färbemethoden sind nicht quantitativ.
9. Post-PCR Aufarbeitung notwendig.
   
   

B) Echt-Zeit ("real-time") PCR  

Die real-time PCR erlaubt es, die Anfangsmenge der Template-DNA zu quantifizieren. Im Gegensatz zur konventionellen PCR werden die mit real-time PCR de novo amplifizierten DNA-Moleküle während der PCR-Reaktion mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten DNA-Primern (bzw. Sonden) detektiert. Gemessen werden die Fluoreszenz-Signale die während der Reaktion ausgestrahlt werden. Auf diese Weise werden vollständige Amplifikationskurven für jede Probe generiert. Die Fluoreszenz ist ein Indikator für die Menge an gebildeten Amplikons (= synth. Amplifikate, DNA-Fragmente, die mit Hilfe der PCR synthetisiert wurden) , während jedes PCR Zyklus (d.h. in Echt-Zeit). Im Unterschied dazu misst die konventionelle PCR nur die Menge des Produktes bzw. der Amplikons, die am Ende der Reaktion vorhanden sind.

Der Echt-Zeit Status oder Ablauf einer Reaktion kann in den meisten real-time PCR Maschinen beobachtet werden.

Mit vorkalibrierten Positivkontrollen oder DNA-Standards läßt sich eine Standardkurve erstellen, die eine akkurate Bestimmung der Konzentration, d.h. die Anzahl kontaminierender Partikel pro Volumeneinheit erlaubt.

Was genau reflektiert die Steigung der Kurven einer real-time PCR?

Die Steigung der detektierten Kurven reflektiert die Amplifikations-Effizienz der Reaktion, das ist die Menge an Kopien eines Amplikons, die während jedes Zyklus' synthetisiert wird. Bei der Erstellung eines real-time PCR Experimentes, ist es wichtig, die entsprechenden Parameter so zu optimieren, dass es mit jedem Zyklus nach Möglichkeit zu einer kompletten Verdopplung der Amplifikate führt.

Welches sind weitere Vorteile einer real-time PCR?

• Verringertes Kontaminationsrisiko: Die real-time PCR Quantifizierung eliminiert post-PCR Aufarbeitung der PCR Produkte, eine Öffnung der Reaktionsgefäße für eine nachfolgende Analyse ist nicht erforderlich.
• Schneller Durchführung: Die Analysedauer ist deutlich verkürzt. Die fehlende post-PCR Aufarbeitung der PCR Produkte führt zur deutlichen Steigerung der Durchsatzleistung.
• Eindeutig: Zum Ausschluss falsch-negativer Ergebnisse (z. B. durch PCR-Inhibition) kann eine interne Kontrolle mitgegeführt werden, die im Falle einer negativen Kontamination nachweisbar sein muss und auf diese Weise die erfolgreiche Durchführung der PCR bestätigt.
• Dynamischer Umfang: Die real-time PCR bietet einen größeren dynamischen Umfang ("dynamic range") von bis zu 10⁷-fach (Vergleich zur konventionellen PCR: 1000-fach).
• Sicher: real-time PCR detektiert nicht die Größe der Amplikons, sie wird nicht durch unspezifische Amplifikation beeinflusst

C) RT-PCR  

Beschreibung

Unser Test ist eine hoch empfindliche Methode zur Detektion von mRNA (messenger RNA) viraler Kontaminanten (z.B. Pestivirus). Die Methode besteht aus zwei Teilen:

1) Die Synthese der cDNA ("complementary" DNA) aus RNA durch reverse Transkription (RT) und
2) die Amplifikation der spezifischen cDNA via PCR ("polymerase chain reaction").

Es liegen zur Zeit keine FAQs vor.