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Für welche Probenmaterialien ist Venor®GeM
geeignet?
Mit Venor®GeM können Mykoplasmen in Zell-
und Viruskulturen sowie viele andere biologische Proben direkt nachgewiesen
werden. Zellkulturüberstände sind für die Testung besonders
gut geeignet. Zellen sollten nicht in die Probe eingebracht werden, da
sie die PCR-Reaktion inhibieren können. Eine kontaminierte Zellkultur
enthält ca. 106 Mycoplasmen/ml. Auch wenn die jeweilige
Mykoplasmenart an der Zelloberfläche anhaften kann, steht ausreichend
Mykoplasmen-DNA im Zellkulturüberstand für einen positiven Nachweis
zur Verfügung. Weiterhin können Gewebeextrakte, Cryokulturen,
fötales Kälberserum, Impfstoffe oder Paraffin-Schnitte nach
einer geeigneten DNA-Extraktion getestet werden.
Wieviel
Probe benötige ich und wann soll ich testen?
Venor®GeM benötigt nur 2 µl Probe
für einen Ansatz. Die Zellen sollten bis zu einer Konfluenz von 90%
kultiviert werden. Die Mykoplasmen sollten dann eine ausreichende Konzentration
im Überstand erreicht haben und eine Inhibition der PCR-Reaktion
vermeidbar sein.
Wie
sensitiv ist Venor®GeM ?
Venor®GeM ist das empfindlichste PCR Mykoplasmen-Detektions
Kit, das es auf dem Markt gibt. Ein erfolgreicher Nachweis erfolgt bereits
ab 2 Mykoplasmen pro Probenvolumen (2 µl).
Wie
ist der Detektions-Bereich von Venor®GeM ?
VenorGeM detektiert mehr als 26 verschiedene Mykoplasmenarten.
Eine vollständige Liste der Arten ist im Benutzerhandbuch aufgeführt.
Ist
die Intensität des PCR-Amplikons proportional zum Kontaminationsgrad?
Venor®GeM für die konventionelle PCR ist
ein qualitativer Test auf Mykoplasmen-Kontaminationen. Eine Bande zwischen
265-278 bp zeigt ein positives Ergebnis unabhängig von der Intensität
an. Grundsätzlich gilt: Eine Bande mit schwacher Intensität
repräsentiert einen niedrigen Kontaminationsgrad, hingegen eine intensive
Bande einen hohen Kontaminationsgrad. Für die Quantifizierung der
Mykoplasmen-Kontamination ist Venor®GeM für
die qPCR erhältlich.
Wie
interpretiere ich unspezifische Banden?
Ein positives Ergebnis liegt nur dann vor, wenn die Bandengröße
mit der positiven Kontrolle korrespondiert. Ist die Bande hingegen länger
bzw. kürzer, so ist das Ergebnis als negativ zu betrachten. Venor®GeM
ist hoch empfindlich und detektiert eine große Bandbreite
an Mykoplasmenarten. Unspezifisches Annealing kann nicht immer ausgeschlossen
werden, ist jedoch sehr selten zu beobachten. Diese unspezifischen Banden
sind oftmals weniger intensiv und unterscheiden sich deutlich in der Größe
vom Mykoplasmen-spezifischen Amplikon. Eine diffuse Bande kann bei 80-90
bp Länge auftreten. Diese Primer-Dimer-Bande ist technisch bedingt
und beeinflusst die Genauigkeit der Ergebnisse nicht.
Können
die Proben gesammelt und später analysiert werden?
Nach der Hitzebehandlung des Zellkulturüberstandes (500 µ
l im 1,5ml Reaktionsgefäß bei 10 min, 95 °C), können
die Proben bis zur Analyse für mehrere Tage bei 4°C gelagert
werden. Für eine längere Aufbewahrungszeit wird empfohlen, die
Proben in ihrem nativen Zustand oder nach der Hitzeinaktivierung bei -20°C
zu lagern.
Wie
werden die PCR-Produkte gelagert?
Die PCR-Produkte sind bei Raumtemperatur ein bis zwei Tage stabil. Für
eine längere Aufbewahrung sollten die PCR-Produkte bei -20°C
aufbewahrt werden. Bei dieser Temperatur können sie länger als
ein Jahr gelagert werden.
Welche
Wasserqualität benötige ich für die Rehydratation?
Das Wasser für die Rehydratation muss frei von DNA sein. Wir empfehlen
UV-bestrahltes Wasser. Zum Lösen der Proben eignen sich auch frisch
destilliertes Wasser, g-bestrahltes Wasser oder Wasser, das mit anderen
Methoden DNA frei aufbereitet wurde. Minerva Biolabs bietet DNA-freies
PCR-Wasser an (Art.-Nr. 55-0010).
Welche
Kontrollen sollten mitgeführt werden?
Es wird sehr empfohlen sowohl die positive als auch die negative Kontroll-Reaktion
für jede Testreihe auszuführen. Besonders wichtig ist die interne
Amplifikationskontrolle, die auch gleichzeitig als Sensitivitätskontrolle
fungiert. Die positive Kontrolle befindet sich in dem Gefäß
mit grünem Deckel, die interne Kontrolle ist im Mastermix enthalten
und die Negativkontrolle enthält DNA-freies Wasser.
Warum
ist die interne Amplifikationskontrolle unbedingt notwendig?
Die interne Amplifikationskontrolle ist nötig, um die Qualität
der PCR zu gewährleisten. Die Proben sollten von Kulturen stammen,
die 80-90% konfluent waren. PCR-inhibierende Substanzen können in
älteren Kulturen im Überstand akkumulieren. Das Auftreten der
interne Kontrollbande bei 191 bp bestätigt, dass die Reaktion nicht
inhibiert wurde und somit erfolgreich verlief.
Welche
inhibitorischen Substanzen im Medium überalterter Kulturen stören
die PCR?
Welche inhibitorischen Substanzen im Medium überalterter Kulturen
auftreten, ist nicht genau bekannt. Es sind möglicherweise Stoffwechselprodukte,
da frisches Serum bzw. Medium nicht stört (es könnte sich um
Transkriptionsstopps handeln, wissenschaftliche Publikationen gibt es
zu dieser Annahme jedoch nicht). Interessanterweise enthalten 37% der
an die Minerva Biolabs GmbH zur Mykoplasmentestung verschickten Proben
inhibitorische Substanzen. Grundregel: Wird das Medium gelb, ist die Inhibition
da.
Verringert
die interne Kontrolle die Sensitivität der PCR?
Nein, die interne Kontrolle verringert die Sensitivität nicht. Die
Oligonukleotid-Primer und die Nukleotide sind optimal konzentriert, so
dass sie keinen negativen Einfluss auf die Empfindlichkeit der PCR-Reaktion
ausüben.
Welche
Arten von Polymerasen können benutzt werden?
Wir empfehlen ausdrücklich Venor®GeM mit
unserer zuverlässigen hot-start MB Taq DNA Polymerase (Art.
Nr. 53-0200) durchzuführen. Nur mit dieser Polymerase können
wir Ihnen optimale Ergebnisse garantieren.
Kann
ein anderer Puffer verwendet werden?
Der Venor®GeM PCR 10x Reaction Buffer
kann gegen einen Taq DNA-Polymerase-spezifischen Puffer ausgetauscht
werden. In diesem Fall muss die Magnesium-Konzentration im Puffer auf
3.0 mM abgeglichen werden.
Wann
sollten Suspensionskulturen idealerweise getestet werden?
Bei Suspensionskulturen sollte nur der Überstand getestet werden.
Zellen selber sollten nicht getestet werden, da nach der Lyse Zelltrümmer
die PCR stören. Bei durchschnittlichen Titern von 10 6 und maximalen
Titern von 10 8 befinden sich genügend Mykoplasmen im Überstand,
um eine sensitive PCR zu garantieren.
Welche
Unterschiede gibt es zwischen Testkits und regulären Kits?
Der Unterschied zwischen einem Testkit und einem vollwertigem Kit liegt
einzig in den Volumina zum Resuspendieren und in der Mastermix-Zusammensetzung.
Der Testkit ist für 5 Reaktionen geeignet, den regulären Kit
können sie für 25, 50, 100 oder 250 Reaktionen käuflich
erwerben.
Tritt
Mycoplasma penetrans tatsächlich intrazellulär auf?
Diese Frage ist bis zum heutigen Zeitpunkt nicht genau zu beantworten.
Wissenschaftliche Beweise, die diese Annahme unterstützen, fehlen.
Ein Nachweis würde voraussichtlich auch bei der Testung von Überstand
positiv verlaufen, da genügend Mykoplasmenpartikel aus abgestorbenen
und lysierten Zellen vorliegen dürfte.
Warum
ist die Bande der Positivkontrolle im Gel nicht sichtbar?
Die Positivkontrolle wird aus Stabilitätsgründen in lyophylisiertem
Zustand geliefert. Das Lyophylisat kann durch den Transport vom Boden
des Röhrchens abgelöst worden sein. Daher muss das Röhrchen
vor dem Öffnen unbedingt kurz zentrifugiert werden, um die DNA vollständig
in Lösung zu bringen.
Welche
Konzentration hat die positive Kontrolle des Venor®GeM
-Kits?
Die positive Kontrolle enthält Amplikon-DNA von relativ kleiner
Fragmentgröße. Das Resuspendieren der DNA resultiert nicht
in einer genauen Konzentration. Die positive Kontrolle dient allein dem
Zweck, positive Ergebnisse durch einen Vergleich der Banden einfacher
zu sehen.
Die Konzentration der positiven Kontrolle variiert von Charge zu Charge.
Zudem befindet sich die DNA nicht in dem Zustand, dass eine zuverlässige
Quantifizierung gemäß der hohen Sensitivität des Testsystems
erreicht werden könnte. Unsere Produkte sind lyophilisiert, um höchste
Stabilität zu garantieren. Diese Bedingung ist jedoch nicht optimal,
um eine genau definierte Menge DNA von der Gefäßwand für
eine Quantifizierung vorzunehmen.
Für eine genaue Quantifizierung empfehlen wir unsere Quantifizierungs-Standards
(Art.-Nr. 52-0112).
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