| DNA
Polymerasen
Wir empfehlen ausdrücklich die Verwendung unserer hot-start MB Taq
DNA Polymerase (Art. Nr. 53-0200). Nur mit dieser Polymerase können
wir Ihnen optimale Ergebnisse garantieren.
Puffer
Kann ein anderer Reaktionspuffer verwendet werden?
Es ist durchaus möglich den Venor® oder
Onar®PCR 10x Reaktionspuffer gegen einen spezifischen Puffer,
der mit Ihrer DNA Polymerase geliefert wird, einzutauschen. Bitte beachten
Sie in diesem Fall, dass die Magnesium-Konzentration des Puffers auf 3.0
mM im Falle von Venor®GeM und 4.0 mM im Falle
von Onar®Lp eingestellt wird.
Primer/Nukleotid Mix
Kann der Primer/Nukleotid Mix ausgetauscht werden?
Der Primer/Nukleotid Mix ist gewissermaßen das Herz unserer Detektions-Systeme.
Eine Modifikation an dieser Stelle würde das gesamte System verändern.
Zudem ist e ine selbstgemachte Lösung zeitintensiv und oft nicht
ausbalanciert.
Interne und positive Kontroll-DNA
Die interne Kontroll-DNA ist ein kloniertes DNA Fragment, das die System-spezifischen
Primer Sequenzen enthält.
Die positive Kontroll-DNA enthält PCR Amplikon DNA. Die Amplikon
DNA wird in lyophilisierter Form angeboten. Die Rehydrierung der Amplikon
DNA ist weder reproduzierbar noch quantitativ. Aus diesen Gründen
ist es nicht möglich eine exakte Anzahl der Genom-Kopien nach der
Rehydrierung anzugeben. Die positive Kontrolle kann daher nicht für
eine Quantifizierung verwendet werden. Für Quantifizierungen bieten
wir entsprechende Quantifizierungsstandards (genomische DNA in Wasser
gelöst; Cat.-No. 52-0XXX) an.
Thermocycler
Welche Thermocycler wurden für die Entwicklung
der "Real-Time" (pPCR) Kits verwendet?
Die QP Detection-Kits wurden auf dem Roche LightCycler® entwickelt.
Die DI Detection-Kits wurden auf dem Cepheid SmartCycler® entwickelt.
Welche Geräte sind kompatibel?
| ABI 7000 SDS
ABI 7300 SDS
ABI 7500SDS
ABI 7700 SDS
ABI 7900 HT SDS
Bio-Rad iCycler |
Cepheid SmartCycler
Corbett Rotor-Gene
MJ Opticon I & II
Roche Light-Cycler
Stratagene Mx3000p
Stratagene Mx4000 |
Welche Geräte sind speziell mit den
'qEP' Detektionskits kompatibel?
Version |
Venor® GeM-qEP
Typ1
für alle qPCR-Geräte außer ABI |
Tests |
25 |
100 |
250 |
Katalog-Nr. |
11-4025 |
11-4100 |
11-4250 |
Version |
Venor® GeM-qEP Typ 2
für ABI Prism |
Tests |
25 |
100 |
250 |
Katalog-Nr. |
11-5025 |
11-5100 |
11-5250 |
Welche spezifischen Modifikationen bezüglich der
chemischen Komposition liegen vor?
Die chemischen Modifikationen beziehen sich ausschliesslich auf die Primer-Nukleotide.
Was sind Scorpions?
Scorpions werden in der "real-time" Amplikon-spezifischen Detektion von
PCR Produkten verwendet. Es handelt sich bei ihnen um fluorogene PCR Primer.
Zwei verschiedene Formate sind denkbar, die schleifenförmige (bzw.
"stem-looped") Variante oder das "Duplex"-Format. In beiden Fällen
verläuft der Hybridisierungs-Mechanismus intramolekular.
Warum verwenden wir Scorpions-Primer für
die quantitativen Diagnostik Assays?
Markierte fluorogene Sonden sind nahezu ideal für den Gebrauch in
diagnostischen Assays. Wir verwenden zwei Scorpions-Varianten, daher kommen
auch zwei unterschiedliche PCR Detektions-Systeme zur Anwendung, das DI-
und QP-Detektions Kit. Auf diese Weise decken wir nahezu alle gängigen
Thermocycler ab und jeder Kunde findet das für ihn geeignete Detektions-System,
speziell für sein "real-time" PCR Projekt.
Wie sind Scorpions aufgebaut und wie funktioniert
die Scorpions-Technologie?
Scorpions enthalten einen Amplifikationsprimer, der durch ein Zwischenstück,
welches einen "Amplifikations-Stopper" enthält, mit einer "Target"-spezifischen
Probe verknüpft ist. Die Sequenzen, die die Sonden-Sequenz flankieren
sind komplementär zueinander und können daher eine Haarnadel-Struktur
bilden. Auf diese Weise wird das Fluorophor mit dem Löschmolekül
in räumliche Nähe gebracht. Während der Amplifikation wird
die Zielsequenz von dem Primeranteil der Scorpions her verlängert.
Während der Denaturierung, öffnet sich die Haarnadelstruktur.
Im Verlauf der Reaktion bindet die "Target"-spezifische Probe beim Abkühlen
an die amplifizierte komplementäre Target-Sequenz, so dass sich die
Haarnadel-Struktur nicht erneut ausbilden kann. Fluorophor und "Quencher"
(Fluoreszenz-Löscher) sind nun getrennt und Fluoreszenzlicht wird
bei entsprechender Anregung detektiert. Der Amplifikations-Stopper verhindert
ein "Durchlesen" während der Amplifikation, welches zwangsläufig
zur Öffnung der Haarnadel-Struktur führen würde und somit
zu einer Fluoreszenz-Detektion in Abwesenheit einer Zielsequenz. Da Scorpions
im Produkt integriert sind, besteht ein direkter Zusammenhang zwischen
der Anzahl generierter Zielmoleküle und der Fluoreszenz-Menge.
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