A) Konventionelle
("End-Point") PCR
Beschreibung
Konventionelle PCR Methoden beziehen sich auf die Gesamtmenge an Produkt,
die am Ende der Reaktion gebildet wurde und nicht auf die jeweilige Menge,
die sich auf einzelne Zyklen der PCR bezieht. Unsere qualitativen Tests
detektieren, ob eine Kontamination (z.B. Mykoplasmen) vorhanden ist oder
nicht.
Warum ist kein Genprodukt sichtbar?
Nicht jede PCR ist erfolgreich. Ursache kann die schlechte Qualität
der DNA sein, inhibierende Faktoren, die die PCR-Reaktion störend
beeinflussen, Primer, die nicht passen oder die Menge an Template-DNA.
Warum hat das Gen-Produkt nicht die richtige Größe?
Es ist möglich, dass z. B. eine Bande von 300 Basenpaaren entsteht,
obwohl das erwartete Genprodukt 600 Basenpaare lang ist. In diesem Fall
bindet ein Primer wahrscheinlich an einer Stelle des Gens, das näher
an dem zweiten Primer lokalisiert ist. Es ist auch denkbar, dass z.B.
beide Primer an verschiedenen Stellen, oder sogar an einem völlig
anderen Gen binden.
Warum hat das Gen-Produkt nicht die richtige Größe?
Es ist möglich, dass die Primer an den gewünschten Genabschnitten
binden, sie aber auch mit weiteren Abschnitten der DNA hybridisieren können.
In diesem Fall kann man verschiedene Banden in einer Bahn des Gels beobachten.
Ein Grund dafür könnte eine zu niedrige "Annealing"-Temperatur
sein. Eine Erhöhung der "Annealing"-Temperatur erhöht die Spezifität
der Amplifikation.
Eine weitere Ursache könnte kontaminierende Fremd-DNA in der Probe
darstellen.
Welches sind die anwendungstechnischen Grenzen der End-Punkt
PCR?
- Relativ zeitintensiv im Vergleich zur qPCR.
- Ergebnisse basieren auf Größen-Unterscheidung, die nicht
sehr genau ist.
- Die Reproduzierbarkeit der Amplifikation ist relativ gering.
- Der End-Punkt variiert von Probe zu Probe.
- Die Agarosegel-Auflösung ist relativ gering.
- Kleiner dynamischer Bereich (kleiner als 2 logs).
- Nicht-automatisiert.
- Ergebnisse durch Färbemethoden sind nicht quantitativ.
- Post-PCR Aufarbeitung notwendig.
B) Echt-Zeit "real-time" PCR (qPCR)
Die qPCR erlaubt es, die Anfangsmenge der Template-DNA zu quantifizieren.
Im Gegensatz zur konventionellen PCR werden die mit qPCR de novo
amplifizierten DNA-Moleküle während der PCR-Reaktion mit Hilfe
von Fluoreszenz-markierten DNA-Primern (bzw. Sonden) detektiert. Gemessen
werden die Fluoreszenz-Signale die während der Reaktion ausgestrahlt
werden. Auf diese Weise werden vollständige Amplifikationskurven
für jede Probe generiert. Die Fluoreszenz ist ein Indikator für
die Menge an gebildeten Amplikons (= synth. Amplifikate, DNA-Fragmente,
die mit Hilfe der PCR synthetisiert wurden) , während jedes PCR Zyklus
(d.h. in Echt-Zeit). Im Unterschied dazu misst die konventionelle PCR
nur die Menge des Produktes bzw. der Amplikons, die am Ende der Reaktion
vorhanden sind.
Der Echt-Zeit Status oder Ablauf einer Reaktion kann in den meisten qPCR
Maschinen beobachtet werden.
Mit vorkalibrierten Positivkontrollen oder DNA-Standards läßt
sich eine Standardkurve erstellen, die eine akkurate Bestimmung der Konzentration,
d.h. die Anzahl kontaminierender Partikel pro Volumeneinheit erlaubt.
Was genau reflektiert die Steigung der Kurven einer
qPCR?
Die Steigung der detektierten Kurven reflektiert die Amplifikations-Effizienz
der Reaktion, das ist die Menge an Kopien eines Amplikons, die während
jedes Zyklus' synthetisiert wird. Bei der Erstellung eines qPCR Experimentes,
ist es wichtig, die entsprechenden Parameter so zu optimieren, dass es
mit jedem Zyklus nach Möglichkeit zu einer kompletten Verdopplung
der Amplifikate führt.
Welches sind weitere Vorteile einer qPCR?
- Verringertes Kontaminationsrisiko: Die qPCR Quantifizierung eliminiert
post-PCR Aufarbeitung der PCR Produkte, eine Öffnung der Reaktionsgefäße
für eine nachfolgende Analyse ist nicht erforderlich.
- Schneller Durchführung: Die Analysedauer ist deutlich verkürzt.
Die fehlende post-PCR Aufarbeitung der PCR Produkte führt zur deutlichen
Steigerung der Durchsatzleistung.
- Eindeutig: Zum Ausschluss falsch-negativer Ergebnisse (z. B. durch
PCR-Inhibition) kann eine interne Kontrolle mitgegeführt werden,
die im Falle einer negativen Kontamination nachweisbar sein muss und
auf diese Weise die erfolgreiche Durchführung der PCR bestätigt.
- Dynamischer Umfang: Die qPCR bietet einen größeren dynamischen
Umfang ("dynamic range") von bis zu 107-fach (Vergleich zur
konventionellen PCR: 1000-fach).
- Sicher: qPCR detektiert nicht die Größe der Amplikons,
sie wird nicht durch unspezifische Amplifikation beeinflusst
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