Fehlersuche und FAQ

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Was sind Mykoplasmen?  

"Mykoplasmen" beschreibt Mitglieder der Gattung Mycoplasma in der Klasse der Mollicutes, die eine Gruppe von winzigen, zellwandlosen Bakterien bilden und über 120 Spezies umfassen. Sie sind die kleinsten selbst-replizierenden prokariotischen Organismen. Aufgrund ihres kleinen Genoms (600-1700 kb in Abhängigkeit von der Art) fehlen den Mykoplasmen viele Stoffwechselwege, und sie sind abhängig davon, Nahrung aus ihrer Umgebung zu bekommen. Ihre geringe Größe (~ 0.15 µm) erlaubt es Ihnen, die handelsüblichen 0.22- bzw. 0.45-µm Sterilisationsfilter zu passieren. Zudem sind sie gegen Antibiotika wie Penicillin und Streptomycin resistent.

Übliche Kontaminanten sind: Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma argininii, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Acholephasma laidlawii, Mycoplasma pneumoniae und Ureaplasma urealyticum.

Was ist das eigentliche Problem bei Kontaminationen mit Mykoplasmen?  

Mykoplasmen sind Parasiten und viele von Ihnen stellen Krankheitserreger dar, die eine Vielzahl tierischer Wirte infizieren können. Bei Menschen sind Mykoplasmen meistens Oberflächenparasiten, die sich auf den obersten Zellschichten des respiratorischen und urogenitalen Trakts ansiedeln. Mykoplasmen sind häufige und ernsthafte Kontaminanten in Zellkulturen. Mykoplasmenkontaminationen sind ein weitverbreitetes Problem in Laboratorien, in Abhängigkeit von der Anzahl und Art der kultivierten Zelllinien und dem angewendeten Qualitätsmanagementsystem. Verschiedene Studien belegen, dass je nach Region 15-85% aller Zellkulturen mit Mykoplasmen kontaminiert sind. Eine Zellkulturinfektion mag eine längere Zeit ohne offensichtliche Zellschäden andauern, kann aber nahezu jeden Parameter des Zellstoffwechsels beeinflussen, einschließlich der Änderung der phenotypischen Charakteristik der Zellen und des normalen Wachstums.

Ist Trypsin eine mögliche Quelle für Kontaminationen in Zellkulturen?  

Trypsin wird aus Bauchspeicheldrüsen von Schweinen gewonnen und daher für eine Quelle von Mycoplasma hyorhinis-Kontaminationen gehalten. Mycoplasma hyorhinis wird jedoch von Trypsin bei Raumtemperatur in nur wenigen Minuten lysiert und stellt damit keine Kontaminationsquelle dar.

Kann eine Mykoplasma-Kontamination mit dem Auge erkannt werden?  

Nein. Mykoplasmen sind zu klein, um mit dem bloßen Auge erkannt zu werden. Sie können nur durch Elektronenmikroskopie beobachtet werden. Ein sensitiver Nachweis von Mykoplasmenkontaminationen kann daher nur indirekt, z. B. mit dem Venor^®GeM Mycoplasma Detection Kit erfolgen.

Wie können Mykoplasmen diagnostiziert werden? 

Es ist wichtig anzumerken, dass eine Mykoplasmeninfektion normalerweise mit einem Mikroskop unauffindbar ist. Deshalb wurden für die Diagnostik von Mykoplasmenkontaminationen eine Reihe von Nachweisverfahren entwickelt. Diese Verfahren schliessen die folgenden Techniken ein: DNA Fluoreszenzfärbung, RNA Hybridisierung, Elektronenmikroskopie und die im Allgemeinen aufgrund ihrer höheren Sensitivität eher verwendete ELISA-Technik. Innerhalb der letzten Jahre wurde die PCR-Technologie für den Nachweis von Mykoplasmen angepasst und hat sich als mächtiges und zuverlässiges Werkzeug zur Mykoplasmenkontrolle erwiesen.

Was ist das Prinzip des Venor^®GeM Detektionssystems?  

Die Minerva Biolabs GmbH bietet das Venor^®GeM System an, das nahezu alle Mykoplasmenspezies, die als natürliche Kontaminanten in Zellkulturen auftreten, detektiert (z.B. M. orale, M. hyorhinis und A. laidlawii). Venor^®GeM basiert auf der PCR Technology und benutzt die konservierte 16S RNA kodierende Region, die Mykoplasmen-spezifisch ist, als sogenanntes "Template".

Welches sind die Vorteile von Venor^®GeM?  

Wir bieten Venor^®GeM für die konventionelle und für die qPCR an. Venor^®GeM ist aufgrund der gezielten Primerauswahl, den optimierten Reagenzien und der mitgelieferten Kontrollen der zuverlässigste PCR Testkit. Die PCR-Detektion beruht auf der Amplifikation einer hoch konservierten Region der 16s rRNA im Mycoplasmen-Genom. Das spezifische PCR-Produkt hat eine Grösse von 270 bp und wird im Agarosegel sichtbar gemacht. Die interne Kontrolle zeigt an, ob die Amplifikation erfolgreich war. Positiv- und Negativkontrolle erleichtern die Interpretation der Ergebnisse. Die qPCR hingegen erlaubt die einfache Quantifizierung des Mykoplasmen-Anteils in der Probe. Weitere Vorteile von Venor^®GeM sind die leichte Handhabung des validierten Testsystems, die durch ein leicht verständliches Handbuch noch unterstützt wird. Venor^®GeM ist hoch-sensitiv (1.5 Kopien/µl DNA) und schnell durchführbar.

Wann sollte Venor^®GeM benutzt werden? 

Das Venor^®GeM System wurde für die Detektion von Mykoplasmen in der Zellkultur, in Virus-Kulturen und anderen biologischen Materialien entwickelt. Die Zellen können sowohl aus einer Kultur oder direkt aus Gewebeextrakten stammen.

Welche Probenmenge erfordert der Test?  

Das Venor^®GeM System benötigt nur 2 µl Probe. Die Zellen sollten bis zu einer Konfluenz von 90% kultiviert werden, um eine maximale Dichte von Mykoplasmen zu garantieren. Eine hohe Mykoplasmenkonzentration vermindert die Gefahr einer möglichen Inhibition der PCR durch das Probenmaterial.

Wie erfolgt die Probenvorbereitung ?  

Die PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) ist eine sehr sensitive Methode und bedarf besonderer Vorkehrungen bei der Probennahme. Besonders wichtig ist die Vermeidung von Kontaminationen mit Fremd-RNA bzw. -DNA, da es sonst zu falsch positiven Ergebnissen kommt. Die Probennahme sollte mit Einmal-Handschuhen erfolgen und das Probenmaterial sollte sofort in sterile Probengefäße überführt und gut verschlossen werden.

Heparin-Zusätze sind nicht geeignet, da sie die PCR-Reaktion hemmen. Probenmaterialien wie z. B. Sputum, BAL, Liquor, Urin, Sekrete, Punktate, Fruchtwasser und Aszites sollten in sterile Röhrchen ohne Zusätze überführt und ebenfalls gut verschlossen werden. Gewebeproben (z. B. Biopsieproben) werden in sterile Röhrchen mit physiologischer Kochsalzlösung überführt und in dieser Form für eine DNA-Extraktion vorgehalten.

Welche Materialien werden für die Detektion benötigt?  

Ein PCR Thermocycler (und im Fall einer konventionellen PCR ein Gelelektrophoresesystem), Pipetten, sterile Reaktionsgefäße, PCR-Gefäße, Spitzen, RNA- und DNA freies Wasser werden u.a. für die Mykoplasmen Detektion benötigt.

Welche Kontrollen sollten durchgeführt werden?  

Wir empfehlen eine positive und eine negative Kontrollreaktion in jeder Testserie mitzuführen. Diese Kontrollen gewährleisten eine sichere Auswertung der Tests unter geeigneten Testbedingungen. Die interne Kontrolle (resultiert in ein 191 bp grosses DNA-Fragment) sollte in jeder Reaktion integriert sein, um falsch-negative Ergebnisse, die von einer PCR Inhibition herrühren, ausschliessen zu können.

Welche Konzentration von DNA ist in der Positivkontrolle enthalten? 

Die in unseren Kits enthaltene Positivkontrolle ist ausschließlich als Auswertungshilfe gedacht und kann nicht als Sensitivitätskontrolle verwendet werden. Es handelt sich bei der Positivkontrolle um gefriergetrocknete Amplikon-DNA. Dieses Material kann leider prinzipiell nicht reproduzierbar rehydratisiert werden. Für eine Sensitivitätsüberprüfung Ihres PCR-Systems empfehlen wir unsere Quantifizierungsstandards mit genau eingestellter Konzentration an genomischer DNA (Kat.Nr. 52-0112 u.a.).

Können die aufbereiteten Proben für spätere Analysen aufbewahrt werden?  

Nach einer Hitzebehandlung (5 min, 95°C) kann der Zellkulturüberstand vor der Analyse für mehrere Tage bei 4°C gelagert werden. Eine Langzeitaufbewahrung sollte bei -20°C durchgeführt werden, die Proben sollten dabei in ihrem nativen Zustand oder Hitze-inaktiviert vorliegen.

Wie lange dauert die Durchführung des Tests?  

Die Detektion von Mykoplasmen DNA mit Venor^®GeM dauert ungefähr 3-4 Stunden bis zum Ergebnis. Bei einer DNA Extraktion nimmt die Probenvorbereitung ca. 15 Minuten in Anspruch, die Reaktionsmischung (15 Minuten), der PCR Schritt (ca. 2 Stunden) und die Gelelektrophorese (20 Minuten). Zum Vergleich: die quantitative PCR (z.B. Venor^®GeM-QP) benötigt mit dem LightCycler^® maximal 1 Stunde.

Was empfiehlt Minerva Biolabs?  

Ein Mykoplasmen-Test sollte in regelmäßigen Intervallen durchgeführt werden. Wir empfehlen, Kulturen jeden Monat zu testen, neue Kulturen bzw. Zellen sofort und Kulturen, die eingefroren werden sollen, vor der Konservierung zu testen. Auffällige Kulturen sollten sofort untersucht werden.

Wie kann Minerva Biolabs helfen?  

Minerva Biolabs bietet Ihnen höchste Zuverlässigkeit und bestmögliche Qualitätssicherung. Als Experten auf dem Gebiet mikrobieller Kontaminationen, besonders im Bereich Mykoplasmen-Kontaminationen, wissen wir mit nahezu allen Schwierigkeiten umzugehen. Wir sind in hohem Maße flexibel, so dass wir Ihnen jederzeit unsere Unterstützung für Ihr spezielles Anliegen anbieten können.

Sie erreichen uns unter der Nummer Tel.: +49 (0)30 2000 4370 oder per E-mail: support@minerva-biolabs.com.